Invitrogen™ LeukoLOCK™ Totalt RNA-isoleringssystem

De LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System är en innovativ metod för cellulär fraktionering av helblod och total RNA-stabilisering och extraktion från leukocytpopulationen. Satsen består av en LeukoLOCK Fraktionering& Stabiliseringssats (finns även separat; Kat.nr AM1933) och en LeukoLOCK Total RNA-isoleringskit.

De LeukoLOCK Systemet är optimerat för användning med mänskligt blod. Blod är ett förråd av cellulär information; emellertid kan närvaron av globin-mRNA i RNA framställt från helblod störa nedströms expressionsprofileringstillämpningar. De LeukoLOCK Systemet använder filterbaserad leukocyt-utarmningsteknik för att isolera leukocyter från helblod och RNA senare™ lösning för att stabilisera cellerna på filtret. Genom att utesluta röda blodkroppar är RNA:t som renas från infångade leukocyter i sig utarmat på globin-mRNA, vilket förbättrar provets användbarhet för uttrycksprofilering och andra tillämpningar.

Leukocytfångning och stabilisering
Ett 9 –10 ml prov av antikoagulerat blod passerar genom en LeukoLOCK filter, som fångar den totala leukocytpopulationen samtidigt som det eliminerar röda blodkroppar (inklusive retikulocyter), blodplättar och plasma. Efter sköljning med fosfatbuffrad koksaltlösning, spolas filtret med RNA senare lösning för att stabilisera RNA:t i de infångade leukocyterna. RNA:t kan isoleras omedelbart, eller stabiliserade celler kan bibehållas i flera dagar vid rumstemperatur eller under längre perioder kl.– 20 °C eller– 80 °C.

RNA-isolering
Rening av RNA görs genom att först förstöra de fångade cellerna i en guanidiniumtiocyanatbaserad lösning –som frisätter RNA:t samtidigt som nukleaser inaktiveras. Cellysatet samlas upp och behandlas kort med Proteinas K. RNA renas sedan från lysatet med MagMAX magnetisk pärlbaserad teknologi för tvättning, följt av DNase-behandling (med TURBO DNase™ ) och slutstädning.

Expressionsstudier
Både kvantitativa RT-PCR- och mikroarray-expressionsstudier har validerat det renade RNA:ts lämplighet för tillförlitlig transkriptomprofilering. Jämfört med RNA som bearbetats med ett vanligt använt blod-RNA-isoleringsförfarande, RNA isolerat med LeukoLOCK Systemet producerar längre median-aRNA efter amplifiering och högre procentandel närvarande samtal utan att kräva ytterligare efterextraktionssteg för att avlägsna globin-mRNA. Eftersom globin-aRNA representerar –25 40 % av aRNA-toppen från total-RNA i helblod, är utbytet av totalt RNA förståeligt lägre med metoder som utarmar oönskade globintranskript. RNA amplifieras efter LeukoLOCK rening erbjuder större arraykänslighet på grund av den dramatiska minskningen av konkurrerande globintranskript.

Kit ger
Återhämtningen varierar från givare till givare, men är vanligtvis –10 20μ g RNA per –9 10mL helblod. RNA återvunnet med hjälp av LeukoLOCK Systemet innehåller mindre än en tiondel av mängden retikulocyt-härledda alfa- och beta-globin-mRNA som finns i typiska RNA-prover från ofraktionerat helblod.

• Fraktionerar leukocyter från helblod på några minuter
• Extraherar totalt RNA från leukocyter
• Inga ytterligare globinreduktionssteg krävs
• Stabiliserar RNA för att bevara uttrycksprofilen
• Bevarar leukocyter i rumstemperatur i dagar

Inte kompatibel med hög genomströmning (manuell)