Invitrogen™ m MEDDELANDE mMACHINE™ T7 Transcription Kit

Hur mMESSAGE-kit mMACHINE fungerar

mMESSAGE-kit mMACHINE har ett förenklat reaktionsformat där alla fyra ribonukleotiderna och kapselanalogen blandas i en och samma lösning. Kapselanalog:GTP-förhållandet för denna lösning är 4:1, vilket är optimalt för att maximera både RNA-utbytet och andelen avslutade transkript. mMESSAGE-kit mMACHINE är idealiska för rutinmässig syntes av kapslade RNA för oocytmikroinjektion, in vitro-translation , transfektion och andra tillämpningar. De höga utbytena uppnås genom att optimera reaktionsförhållandena för RNA-syntes i närvaro av höga nukleotidkoncentrationer. Dessutom skyddas det syntetiserade RNA:t från nedbrytning av eventuella kontaminerande ribonukleaseser som kan finnas med RNase-hämmaren—, en komponent i enzymblandningen.

Användning av mMESSAGE-kit mMACHINE

Vid en 20 μl-reaktion under en två timmars inkubation ger mMESSAGE mMACHINE högavkastande capped RNA-transkription stora massor av capped RNA. Upp till 10 –till 50 gånger utbytet som uppnåtts med konventionella in vitro-transkriptionsreaktioner. Förhållandet mellan cap-analog och GTP har optimerats för att möjliggöra bästa kompromiss mellan utbyte (15 ––35 μg) och andelen transkript som är begränsade (80%).

mMESSAGE-kit mMACHINE innehåller också en LiCl-fällningslösning som är effektiv för att separera proteiner och oinkorporerade nukleotider (inklusive free cap-analog) från det täckta RNA:t, vilket möjliggör ökad translationseffektivitet. mMESSAGE-kit mMACHINE är endast optimerade för användning med de polymeraser som ingår i kitet. Att använda en annan polymeras kan ge låga avkastningar. mMESSAGE-kiten mMACHINE innehåller alla buffertar och reagenser som behövs för 25 transkriptionsreaktioner. Med hjälp av kontrollmallen som medföljer kiten (Xenopus elongation factor 1α, pTRI Xef) kommer varje mMESSAGE-reaktion mMACHINE att ge cirka 20 ––30 μg RNA med T3 T7-RNA-polymeras eller cirka 15 –stycken 25 μg RNA med SP6-RNA-polymeras.