Invitrogen™ TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit

De TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit gör det möjligt att utföra expressionsanalys direkt från odlade celler utan RNA-rening. Detta kit sparar tid och erbjuder ett enkelt arbetsflöde som lämpar sig för några få prover eller enkelt kan integreras i automatiserade applikationer med hög genomströmning.

De TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T Kit är:
• Komplett —optimerat arbetsflöde inkluderar cellysreagens med gDNA-borttagning, RT-enzymmix, buffert och ny TaqMan™ Gene Expression Master Mix
•Snabb 7-—minuters provförberedelse, inklusive DNase-behandling, vid rumstemperatur
•Lätt lysera prover i —ett rör eller direkt i odlingsplattor
•Robust utföra genuttrycksanalys på —10 100 000 celler per prov; resultat ekvivalenta –med de från renat RNA
•Efficient innehåller tillräckligt med reagens för —att generera 500 realtids-PCR-resultat från 100 startprover. Med en unik metod för

lysering av odlade celler samtidigt som genomiskt DNA tas bort och RNA-integriteten bevaras, TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T Kit innehåller™ reagenser för omvänd transkription (RT) för cDNA-syntes och TaqMan™ Gene Expression Master Mix för PCR-analys i realtid. TaqMan™ primerprobset ⁄säljs separat.

Enkel 7-minuters provberedning: del av ett komplett
arbetsflöde Oavsett om du använder plattor eller rör, TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit, som använder den enkla 7-minuters provberedningsproceduren som beskrivs (se figur), är utformad för –10 100 000 odlade ⁄cellprov. Celler tvättas i PBS och lyseras i lösning under 5 minuter vid rumstemperatur; DNas-behandling kan utföras samtidigt. Lyseringen avslutas vid rumstemperatur genom en 2-minuters inkubation med stopplösning. Lysaten är nu redo för omvänd transkription eller lagring kl– 20 °C. Eftersom prover kan bearbetas direkt i odlingsbrunnar (96 eller 384 brunnar) minimeras provhanteringen och risken för provförlust eller överföringsfel, vilket underlättar snabb bearbetning med hög genomströmning. Till skillnad från gammaldags RNA-isoleringsprotokoll i flera steg krävs inga steg för uppvärmning, tvättning eller centrifugering. Satsen förenklar avsevärt en mödosam 30 –60 minuters process och minskar den till 7 minuter.

De TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit arbetsflöde möjliggör oöverträffad utvärdering av genuttryck med någon av> 700 000 TaqMan™ Genuttrycksanalyser. Detta kit har testats omfattande för specificitet med ett brett urval av TaqMan™ Genuttrycksanalyser och visar prestanda motsvarande den som erhålls med renat RNA (se figur).

Uppnå oöverträffad prestanda och känslighet
Till skillnad från vissa konkurrerande kit som begränsar mängden lysat i RT-reaktionen till 5 %, TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T Kit™ kan ta emot 45 % av den totala RT-reaktionsvolymen som cellysat. Dessutom kan cDNA utgöra upp till 45 % av realtids-PCR-reaktionsvolymen. Den stora lysatvolymen i den optimerade RT-reaktionen, tillsammans med den stora cDNA-volymen i den efterföljande realtids-PCR med TaqMan™ Gene Expression Master Mix, leder till maximal känslighet. Mastermixen förstärker målet exakt och exakt, vilket möjliggör detektering av små kvantiteter av mål, såsom transkript som uttrycks vid låga nivåer.

Förmågan att detektera begränsade målkvantiteter testades genom att blanda ett konstant antal mänskliga celler med olika antal musceller. Cellblandningarna framställdes med användning av TaqMan™ Genuttryck celler-till- _CT och™ analyserades för en mus-specifik och human-specifik gen. Jämförande data genererades på samma sätt med RNA renat med traditionell metodik. Data visar att RNA från så få som 10 musceller kunde detekteras i en bakgrund av RNA från 10 000 mänskliga celler (se figur). Förmågan hos TaqMan™ Gene Expression Cells-to- _CT Kit för™ att detektera transkript med relativt låg förekomst var ekvivalent med det för renat RNA; på låga nivåer var det överlägset.

Dessutom prestanda för TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit jämfördes med konkurrerande lysatkit och med renat RNA. Inmatningar av –100 100 000 ⁄cellers lysreaktion undersöktes. Känsligheten hos TaqMan™ Cells-to- _CT Kit-protokollet™ var ekvivalent med det som erhölls med renat RNA, och det överträffade konkurrerande lysat (se figur). Dessutom visar bristen på hämning vid höga cellulära insatser och den låga variationen mellan tekniska replikat tillförlitligheten av detta tillvägagångssätt för studier av genuttryck med odlade celler.

Beprövad prestanda, beprövad tillsammans
Alla komponenter i TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit har optimerats för konsekvent och pålitlig prestanda. Detta tar bort gissningarna som är involverade i att montera separata provberednings-, RT- och realtids-PCR-kit. Och den TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit har validerats med TaqMan™ Genuttrycksanalyser för extra kvalitetssäkring.

Tillbehörsprodukt The
TaqMan™ Cells-to-C _T™ Control Kit designades för användning med TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C _T™ Kit. Detta kit innehåller en endogen kontroll (ACTB) för att normalisera för provladdningsvariabilitet och en artificiell XenoRNA™ kontroll och motsvarande TaqMan™ Genuttrycksanalys för att övervaka effekterna av PCR-hämning.