Thermo Scientific™ CellSensor™ irf1- bla TF-1 cellinje

Jak/Stat-signaleringsvägar spelar väsentliga roller i cellulära svar på distinkta cytokiner. En av Jak/Stat-vägarna, Jak2/Stat5, förmedlar cellproliferation som svar på Interleukin-3 (IL-3), prolaktin, erytropoietin (Epo) och granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF). JAK2-genknockout orsakar embryonal dödlighet på grund av defekt erytropoes, vilket tyder på att Jak2/Stat5-vägen spelar en viktig roll i bildandet av röda blodkroppar.

Den senaste upptäckten av en aktiverande mutation i JAK2 (V617F) som finns hos en hög andel av patienter med myeloproliferativ sjukdom (MPD) tyder på att Jak2/Stat5-vägen kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för vissa former av MPD. Den aktiverade Stat5-transkriptionsfaktorn känner igen och binder till en specifik palindromisk DNA-sekvens som finns i promotorregionen avβ -kasein, interferon regulatorisk faktor-1 (irf-1) och ett antal andra gener. De CellSensor™ irf1-bla TF1-cellinjen innehåller en beta-laktamasreportergen under kontroll av irf-1-svarselementet stabilt integrerat i TF1-celler. TF1-celler är en human erytroleukemicellinje som är tillväxtberoende på GM-CSF och har en intakt GM-CSF-JAK2-STAT5-väg.

Denna cellinje är validerad för EC ₅₀ och Z'-faktor med användning av GM-CSF. Denna cellinje har också testats under varierande experimentella förhållanden, inklusive DMSO-koncentration, cellantal, stimuleringstid och substratladdningstid. Responsen på EPO och Jak Inhibitor 1 testades också (figur 2 och 3). CellSensor™ irf1-bla TF1-celler stimulerades i tre exemplar med GM-CSF över det angivna koncentrationsintervallet i ett format med 384 brunnar. Celler inkuberades under 5 timmar. med agonist och 0,5 % DMSO och sedan kombinerad med LiveBLAzer™ -FRET B/G-substrat (CCF4-AM) i 2,5 timmar. Fluorescensemissionsvärden vid 460 nm och 530 nm erhölls med användning av en standard fluorescensplattläsare. Förhållandena 460/530 plottades för varje replikat mot de angivna koncentrationerna av GM-CSF. CellSensor™ irf1-bla TF1-celler stimulerades med Epo över det angivna koncentrationsintervallet i ett format med 384 brunnar.

Svarsförhållandena plottades mot de angivna koncentrationerna av Epo. CellSensor™ irf1-bla TF1-celler behandlades med Jak Inhibitor 1 över det angivna koncentrationsintervallet i ett format med 384 brunnar. Celler stimulerades sedan med GM-CSF eller EPO under 5 timmar. i 0,5 % DMSO och sedan kombineras med LiveBLAzer™ -FRET B/G-substrat (CCF4 - AM) i 2,5 timmar. Fluorescensemissionsvärden vid 460 nm och 530 nm erhölls med användning av en standard fluorescensplattläsare. Dessa värden omvandlades till procentuell inhibering i förhållande till en uppsättning kontroller (ostimulerade celler och EC80 av GM-CSF eller EPO-behandlade celler) och plottades mot de angivna koncentrationerna av Jak Inhibitor 1.

Akademiska och ideella kunder, vänligen fråga efter specialpriser.