Invitrogen™ Click-iT™ EdU Proliferation Assay för mikroplattor

Efter inkorporering av EdU (en modifierad tymidinanalog) i nysyntetiserat DNA, fästs pepparrotsperoxidas (HRP) kovalent via den mycket specifika klickreaktionen. Amplex UltraRed Reagent, ett HRP-substrat, tillsätts sedan och den resulterande fluorescenssignalen detekteras. På grund av den mycket specifika bindningen av HRP till EdU, resulterar denna analys i mycket känslig och tillförlitlig mätning av däggdjurscellproliferation i ett mikroplattformat.

Click-iT EdU Proliferation Assay for Microplates funktioner inkluderar:
• Förbättrad prestanda —direkt konjugering av HRP till inkorporerad EdU förbättrar analysens känslighet och noggrannhet
•Ökad tillförlitlighetsanalysformat —resulterar i låg variabilitet från brunn till brunn
•Förenklat protokoll —resulterar i minskad tid till data; lättare att följa protokollet
•Multiplex-aktiverad —analys kan enkelt multiplexeras med andra cellhälsoreagenser vilket resulterar i mer data per prov.

Att mäta cellproliferation är en grundläggande metod för att bedöma cellhälsa, bestämma genotoxicitet och utvärdera anticancerläkemedel. Den mest exakta metoden för att mäta proliferation är genom direkt detektering av DNA-syntes. Ursprungligen åstadkoms detta genom inkorporering av en radioaktiv nukleosid (t.ex. ^{^} H-tymidin). Denna metod ersattes av antikroppsbaserad detektion av nukleosidanalogen bromo-deoxiuridin (BrdU). Efter inkorporering av BrdU i det nysyntetiserade DNA:t krävs denaturering för att exponera BrdU-molekylerna för anti-BrdU-antikroppen. Denatureringen involverar hårda metoder (HCl, värme eller enzymer) och är tidskrävande och svår att utföra konsekvent.

De Click-iT EdU Proliferation Assay är ett alternativ till BrdU-analysen. Nukleosidanalogen EdU (5-etynyl-2´ -deoxiuridin) läggs till levande celler och införlivas i DNA under aktiv DNA-syntes. Den inkorporerade EdU innehåller en alkyngrupp som är kovalent förenad med azidgruppen som finns i HRP med hjälp av en mycket specifik kopparkatalyserad kovalent reaktion ('klickreaktion'). Amplex UltraRed Reagent tillsätts sedan och dess omvandling av HRP till en högfluorescerande produkt registreras med en fluorescensmikroplattläsare (excitation: 568, emission: 585 nm). Med en hög extinktionskoefficient, god kvanteffektivitet och motståndskraft mot autooxidation, Amplex UltraRed Reagent ger högre känslighet och ett bredare analysområde än andra fluorogena eller kolorimetriska HRP-substrat. Den erbjuder också mångsidighet genom detektion genom antingen fluorescens- eller absorbansmätning.