Thermo Scientific™ LanthaScreen™ STAT1 U2OS celllinje

JAK/STAT1-signalvägen är känd för att aktiveras av typ I/II-interferoner såsom interferon-gamma och interferon-alfa. På denna väg resulterar bindning av dessa cytokiner till deras respektive cellytereceptorer i aktiveringen av JAK, som i sin tur fosfoaktiverar STAT1-proteiner vid en specifik tyrosinrest (Y701). LanthaScreen™ STAT1 U2OS är en human cellinje som konstitutivt uttrycker ett GFPSTAT1-fusionsprotein. JAK/STAT1-signaleringsvägen är känd för att vara funktionellt intakt i denna cellinje; därför fungerar GFP-STAT1-fusionsproteinet som ett substrat för IFN-gamma-inducerbar fosforylering av JAK. Med hjälp av denna cellinje har en homogen immunanalys utvecklats där fosforyleringstillståndet för GFP-STAT1 detekteras i cellysat med användning av en terbiummärkt anti-pY701-STAT1 antikropp i en tidsupplöst FRET (TR-FRET) avläsning. GFP-STAT1 DNA-expressionskonstruktionen transfekterades in i U2OS-celler med användning av Lipofectamine™ LTX Reagens, följt av urval med blasticidin.

Denna cellinje är en klonal population isolerad genom flödescytometri med användning av GFP-fluorescens som en sorteringsmarkör. Med hjälp av den lytiska TR-FRET-immunoanalysen valideras denna cellinje för EC50- och Zfi-faktorer under optimerade förhållanden med användning av IFN-gamma som en ligand för JAK-medierad GFP-STAT1-fosforylering. Denna analys har också testats för analysprestanda under varierande experimentella förhållanden, inklusive cellpläteringsdensitet, stimuleringstid, DMSO-tolerans och analysutvecklingstid. Ytterligare information med hjälp av alternativa stimuli och alternativa analysprotokoll är tillgänglig.