Invitrogen™ LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit med CCF4-AM

Bakgrund:
GeneBLAzer™ cellbaserade analyser använder de membrangenomträngliga esterformerna (CCF2-AM och CCF4-AM) av de negativt laddade fluorescerande beta-laktamassubstraten, CCF2 och CCF4. Dessa lipofila estrar kommer lätt in i cellen, där klyvning av endogena cytoplasmatiska esteraser snabbt omvandlar dem till deras negativt laddade former och därigenom fångar dem i cytosolen.

Detektering av GeneBLAzer™ analyserna är FRET-baserade. Varje substrat är märkt med två fluoroforer som bildar ett effektivt FRET-par. I frånvaro av beta-laktamasaktivitet resulterar excitering av kumarin vid 409 nm i den intakta CCF2-molekylen i FRET till fluoresceinet, som avger en grön fluorescenssignal vid 518 nm (Figur 1). I närvaro av beta-laktamasaktivitet separerar emellertid klyvning av CCF2 de två färgämnena rumsligt och stör FRET, så att excitering av kumarin vid 409 nm nu producerar en blå fluorescenssignal vid 447 nm. Denna blå signal kan lätt observeras under ett mikroskop och kan också detekteras som en ökning av den blå kanalavläsningen på fluorescerande mikroplattläsare.

CCF2-AM- och CCF4-AM-substraten är viktiga analyskomponenter för GeneBLAzer™ plattform. Dessa substrat är helt kompatibla med flödescytometri, vilket påskyndar tiden till klonval. Ratiometrisk analys av de blå och gröna signalerna minskar variation från brunn till brunn på grund av skillnader i cellantal och substratbelastning, vilket leder till hög Z´ -faktorvärden och låga variationskoefficienter (CV).

CCF2-AM och CCF4-AM skiljer sig åt med två kol i bryggan som länkar kumarindelen till laktamringen. Båda är i membranpermeabla, förestrade former och kan användas för analyser i intakta celler. CCF4-AM har bättre löslighetsegenskaper (löslig för> 24 timmar) än CCF2-AM och är därför bäst lämpad för screeningapplikationer. Dessutom har CCF4-AM något bättre FRET och därmed något lägre bakgrund än CCF2-AM.

CCF2-FA är i huvudsak CCF2-substratet utan estrarna som finns i AM-versionen. CCF2-FA avförestras och används i cellysattillämpningar, förbi belastningen över cellmembranet och avförestringsstegen. Cellysat är den föredragna metoden för tillämpningar som använder celler som innehåller en cellvägg. CCF2-FA kan också användas som en kontroll för att förvärva excitations- och emissionsspektra för CCF2-AM och CCF4-AM.