Multi-Copy Pichia Expression Kit

• Multi-Copy Pichia Expression Kit innehåller vektorerna pPIC3.5K, pPIC9K och pAO815 för produktion och urval av Pichia -stammar som innehåller mer än en kopia av genen av intresse
• I många fall har ökat antal kopior lett till ökade uttrycksnivåer
• Dessa vektorer är också tillgängliga separat

pPIC9K och pPIC3.5K

• pPIC9K- och pPIC3.5K-vektorerna bär kanamycinresistensgenen som ger resistens mot Geneticin™ Reagens i Pichi a
• Spontan generering av multipla insättningshändelser kan identifieras genom resistens mot ökade nivåer av Geneticin™ Reagens
• Pichia- transformanter selekteras på histidinbristmedium och screenas för deras resistensnivå mot Geneticin™ Reagens
• Förmågan att växa i höga koncentrationer av Geneticin™ indikerar att flera kopior av kanamycinresistensgenen och genen av intresse är integrerade i genomet
• pPIC9K-vektorn styr utsöndring av uttryckta proteiner medan proteiner uttryckta från pPIC3.5K förblir intracellulära.

pAO815

• pAO815 är en Pichia -expressionsvektor designad för att klona flera kopior av en gen till en enda vektor
• Vektorn innehåller ett Bgl II-ställe uppströms om 5´AOX1- genen och ett unikt Ba mH I-ställe nedströms om 3´AOX1- transkriptionstermineringssignal (TT).
• Fyra steg krävs för att generera flera kopior av genen av intresse:
  • 1. Genen klonas in i det unika Ec oRI-stället i vektorn.
  • 2. Konstruktionen digereras med Ba mH I och Bgl II för att frigöra“ uttryckskassett” som innehåller AOX1- promotom, genen av intresse och 3´AOX1 TT.
  • 3. Concatemerer av expressionskassetten genereras genom ligering in vitro .
  • 4. De multipla kopiorna infogas tillbaka i pAO815-vektorn och transformeras till Pichi a.