Thermo Scientific™ ActivX™ Destiobiotin-ATP-sond

ActivX Destiobiotin-ATP eller ADP-prober är nukleotidderivat som kovalent modifierar det aktiva stället för enzymer vid konserverade lysinrester i nukleotidbindningsstället. Strukturen av dessa sönder består av ett modifierat biotin (desthiobiotin) fäst till nukleotiden genom en labil acyl-fosfatbindning. Destiobiotin är en biotinanalog som binder mindre hårt till biotinbindande proteiner, vilket resulterar i bindning som lätt reverseras av biotinförskjutning, lågt pH eller värmedenaturering.

ActivX aktiva ställenanrikningsprober är fördelaktiga för att bestämma aktiva enzymnivåer med användning av analogmärkta prober för att möjliggöra profilering av både inaktiva och aktiva enzymer. De ActivX ATP och ADP-prober märker kovalent det aktiva stället för ATPaser, inklusive chaperoner och metaboliska enzymer, för att möjliggöra deras selektiva anrikning med hjälp av en destiobiotin-tagg.

Destiobiotin-ATP- eller ADP-prober kan användas för att selektivt berika, identifiera och profilera målenzymklasser eller bedöma specificiteten hos enzymhämmare. Eftersom många ATPaser och andra nukleotidbindande proteiner binder nukleotider eller inhibitorer även när de är enzymatiskt inaktiva, tillåter destiobiotinsonderna profilering av både inaktiva och aktiva enzymer i ett komplext prov. Preinkubation av prover med småmolekylära inhibitorer som konkurrerar om aktiva platser kan användas för att bestämma inhibitorbindningsaffinitet. Nukleotidsonder med aktiva ställen kan också användas för att identifiera hämmare utanför mål. Med selektiv anrikning kan man identifiera och profilera målenzymklasser över prover eller kan bedöma specificiteten och affiniteten hos enzymhämmare.

Tillämpningar av ActivX ATP och ADP-sonder:
• Profilera bindningsaffiniteter för små molekyler och hämning av det aktiva stället på ett dosberoende sätt
• Identifiera dussintals till hundratals inhibitormål och off-targets från vävnader, celler och subcellulära proteomer
• Anrikning av enzymer baserat på funktion

. Bedömning av märkning av aktiva ställen med destiobioinprober kan utföras med antingen Western blot eller masspektrometri (MS). För Western blot-arbetsflödet berikas destiobiotinmärkta proteiner för SDS-PAGE-analys och efterföljande detektion med specifika antikroppar. För MS-arbetsflödet reduceras destiobiotinmärkta proteiner, alkyleras och smälts enzymatiskt till peptider. Endast destiobiotinmärkta peptiderna med aktiva ställen berikas för analys med LC-MS/MS. Båda arbetsflödena kan användas för att bestämma inhibitor-målbindning, men endast MS-arbetsflödet kan identifiera globala inhibitor-mål och off-targets.

Dessa produkter är föremål för en etikettlicens för begränsad användning.