Thermo Scientific™ Dulbecco's Modified Eagle's Limiting Medium (DMEM-LM)

Thermo Scientific L-foto-leucin och L-foto-metionin är analoger av L-leucin och L-metionin-aminosyror som har aktiverbara diazirin-sidokedjor som kan kemiskt tvärbinda till intilliggande molekyler när de utsätts för ultraviolett ljus. Liksom deras naturligt förekommande motsvarigheter kan dessa fotoreaktiva aminosyror inkorporeras endogent i den primära sekvensen av proteiner under syntes. Protein-proteininteraktionsdomäner som involverar de syntetiserade proteinerna i deras naturliga miljöer kan sedan tvärbindas kovalent genom aktivering av diaziringrupperna. Traditionella tvärbindningsexperiment kräver tillsats av bifunktionella kemiska tvärbindare och associerade reagenslösningsmedel, vilket negativt kan påverka cellbiologin som studeras. Användning av fotoreaktiva aminosyror minimerar dessa potentiellt skadliga effekter och möjliggör att både stabila och övergående proteininteraktioner i celler kan studeras och karakteriseras med en hög grad av tillförsikt. När de används i kombination med speciellt formulerade begränsande cellmedier som saknar leucin och metionin, behandlas de fotoaktiverbara derivaten som förekommer av naturliga aminosyror av proteinsyntesen på samma sätt som proteinsyntesen. Som ett resultat kan de ersätta leucin eller metionin i den primära proteinsekvensen. När de utsätts för UV-ljus blir diazirinringarna reaktiva mellanprodukter som bildar kovalenta bindningar med närliggande proteinsidokedjor och ryggrader. Naturligt associerande bindningspartners fångas sedan omedelbart. Tvärbundna proteinkomplex detekteras genom minskad rörlighet på SDS-PAGE följt av Western blot-detektion, storleksuteslutningskromatografi, sackarosdensitetsgradientsedimentering eller masspektrometri.

Höjdpunkter:

• In vivo-märkning– införliva fotoreaktiv grupp i proteiner med hjälp av normala cellulära maskiner

• Tvärbindning in vivo– hitta interagerande proteiner i den naturliga cellulära miljön

• Ökad specificitet jämfört med traditionella metoder– tvärbindande interagerande proteiner korrekt placerade vid sina gränssnitt inom proteininteraktionsdomäner

• Kompletterande till traditionella metoder– ger detaljerad karakterisering av proteininteraktioner jämfört med resultat med formaldehyd och andra mer allmänna tvärbindningsmetoder

• Effektiv återhämtning– 90 % proteinåtervinning i cellysat efter tvärbindning

• Kompatibel– tvärbindningsproteiner uttryckta i en mängd olika cellinjer, inklusive HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3 och C6

• Lätt att använda– reagenser är fotostabila under normal laboratoriebelysning, vilket eliminerar behovet av att arbeta i mörker