Invitrogen™ Premo Autofagianalyser med sensor LC3B, p62 eller tandemsensor RFP-GFP-LC3B

Premo Autofagisensorer drar fördel av autofagiassocierade proteiner LC3B eller p62, tillsammans med GFP eller RFP, för att detektera antingen induktion eller hämning av autofagi i celler. De Premo Autophagy-sensorer transduceras med BacMam-teknologi (insekts -Bac ulovirus med en mammalisk promotor), vilket möjliggör entydig visualisering av de chimära proteinerna i autofagosomer. BacMam-reagenser är icke-replikerande i däggdjursceller och därför säkra att hantera. De är också icke-cytotoxiska och färdiga att använda. Till skillnad från typiska expressionsvektorer möjliggör BacMam-reagens titrerbart och reproducerbart uttryck och erbjuder hög samtransduktionseffektivitet; därför kan flera BacMam-reagens lätt användas på samma celler. Nyligen gjorda förbättringar av BacMam-systemet möjliggör effektiv transduktion i ett större antal celler, inklusive neuroner och neurala stamceller (NSC) med ett enkelt ettstegsprotokoll. För att visualisera autofagi, lägg helt enkelt till BacMam Autophagy Sensor i cellerna och inkubera över natten för proteinuttryck, och detektera sedan signal med standardinställningar för GFP och/eller RFP-fluorescens på ditt instrument.

LC3B-proteinet spelar en avgörande roll i autofagi. Normalt finns detta protein i cytosolen, men efter klyvning och lipidering med fosfatidyletanolamin associerar LC3B med fagoforen. Denna lokalisering kan användas som en allmän markör för autofagiska membran. P62-proteinet, även känt som sekvestosomer (SQSTM1), är ett ubitiquitinbindande protein som fungerar som en receptor för laster som är avsedda att brytas ned av det cellulära autofagiska maskineriet. När autofagi induceras, lokaliseras p62-proteinet till autofagosomer och bryts därefter ned. Omvänt, med hämning av autofagi, ackumuleras p62-proteinet i autofagosomen. Således tjänar den subcellulära lokaliseringen av en p62-fluorescerande proteinchimär som en användbar markör för induktion och inhibering av autofagi.

Dessutom, genom att kombinera den syrakänsliga GFP (dvs. Emerald GFP) med en syraokänslig RFP (dvs. TagRFP) i tandemsensorn RFP-GFP-LC3B, kan förändringen från en autofagosom (neutralt pH) till autolysosomen (med ett surt pH) visualiseras genom att avbilda den specifika förlusten av fluorescensen av GFP:n efter fluorescensen fusion. Vid induktion av autofagi, Premo Tandem Autophagy Sensor märker de punkterade autofagosomerna; dessa strukturer är positiva för både GFP och RFP. När lysosomen väl har smält, sjunker pH, vilket släcker GFP, vilket gör att autolysosomer ser röda ut. Dessutom kombinerar man Premo Autophagy Tandem Sensor med den långt röda emitteringen LysoTracker Deep Red (tillgänglig separat) möjliggör en trefärgsanalys av autofagosomal/autolysomal/lysosomal dynamik.

Varje Premo Autophagy assay kit innehåller kloroquin difosfat, som används som en negativ kontroll för att hämma autophagy.

Fördelar med att använda Premo Autofagi-analyser
•Multiplex inspirerad— kombinerar Premo Autophagy Tandem Sensor med den långt röda emitteringen LysoTracker Deep Red möjliggör en trefärgsanalys av fullständig autofagisk vägdynamik
•Mycket effektivt leveranssystem— >90 % transduktion av ett brett spektrum av däggdjurscellinjer, inklusive primära celler, stamceller och neuroner
•Snabbt och bekvämt— lägg bara till Premo Autophagy-reagens till dina celler, inkubera över natten —och avbilda eller lagra frysta, analysklara celler för senare användning
•Robust— Premo Autofagireagens är icke-replikerande i däggdjursceller, saknar observerbar cytopatisk effekt och är lämpliga för biosäkerhetsnivå (BSL) 1-protokoll
• Flera konfigurationer: — Premo Autophagy-sensorer är tillgängliga i följande chimära konfigurationer:
P36235: LC3B-GFP; kontroll LC3B (G120A)-GFP; P36236: LC3B-RFP; kontroll LC3B (G120A)-RFP; P36239: RFP-GFP-LC3B; P36240: GFP-p62; P36241: RFP-p62