Melford Proteinas K

Från albumet Tritirachium. Serinproteas för proteolytisk inaktivering av nukleaser under isolering av DNA och RNA.

Beskrivning

Proteinas K är ett mycket reaktivt serinproteas som uppvisar en förmåga att smälta naturliga proteiner och därigenom inaktivera enzymer såsom DNas och RNas utan att behöva använda en denatureringsprocess. Det är det mest kraftfulla proteinaset bland alla proteinaser som hittills har karakteriserats. Den klyver vid peptidbindningen intill karboxylsyragruppen av alifatiska, aromatiska eller hydrofoba aminosyror.

Rekombinant proteinas K används vid isolering eller framställning av nukleinsyror med hög molekylvikt. Den är mycket ren har en högre specifik aktivitet och är mer stabil vid rumstemperatur jämfört med naturligt proteinas K.

Rekombinant proteinas K uttrycks från jäst Pichia pastoris med en klonad gen som kodar för Engyodontium album (Tritirachium album) endolytiskt proteas.

Användningsområden

• Rekombinant Proteinas K är extremt effektivt på naturliga proteiner och kan därför användas för att snabbt inaktivera endogena nukleaser såsom RNaser och DNaser. Denna egenskap gör Proteinas K särskilt lämplig för isolering av naturligt RNA och DNA från vävnader eller cellinjer.
• Används för analys av membranstrukturer genom att modifiera proteiner och glykoproteiner på cellytor.
• Särskilt väl lämpad för att isolera nukleinsyror för amplifieringsreaktioner.
• Främjar cellys genom att aktivera en bakteriell autolytisk faktor.
• Används för att avlägsna cellrester under beredningen av kolonilyft och för att behandla vävnadssektioner för att säkerställa effektiv sondinfiltration under in situ hybridisering.

Rekonstitutionsrekommendationer:

För framställning av stamlösning föreslår vi att det lyofiliserade pulvret rekonstitueras i en buffert (20 mM Tris, 1 mM _CaCl2 , 2% glycerol, pH 7,4).

Kalcium är viktigt för termostabiliteten hos Proteinas K och pH-värdet är avgörande för hög löslighet.

Användningen av kryoskyddande glycerol till en slutlig koncentration av 50 % i stamlösning är för att förhindra frys-/upptiningsskador. Proteinas K bibehöll 99 % av aktiviteten efter 12 frys-/upptiningscykler i stamlösning. Undvik upprepad frysning och upptining för att förhindra utfällning av proteinet om glycerol inte tillsätts.

Proteinas K-lösning förblir aktiv över ett brett pH-område (4,0-12,5, används ofta i intervallet 7,5-9,0) och över ett brett temperaturområde på 25 C °till 75 °C. Lösningen förblir steril och stabil i minst 12 månader vid 4 °C.

Varning: Proteinas K rekombinant lyofiliserat pulver är inte sterilt. Stamlösning kan beredas som en 20-40 mg/ml i 20 mM Tris-HCl-buffert, steriliserad med en 0,22μ m filter. Stamlösning kan lagras i 50 % glycerol i alikvoter vid ett brett temperaturområde från 24 C °till -80 °C.

För sterilfiltrering rekommenderar vi att man använder PES pr PVDF-membran med låg proteinbindning.

Sammansättning (inga tillsatser):

• ≥90 % proteinproteinas K, biurettest.
• Hjälpämnen: Sackaros 8%
• DNA och RNA fri
• Endotoxinfri

Specifikationer:

• Stabil och aktiv över ett brett pH-intervall på 4 till 12, Maximal Activity ligger inom pH-intervallet 7,5 till 12,0
• Aktiv med SDS, urea och EDTA. Den mest aktiva temperaturen är 65 °C.
• Inaktiverad av diisopropylfluorfosfater (DFP) och fenylmetansulfonylfluorid (PMSF).
• Rening: Nickelaffinitetskromatografi följt av jonbyteskromatografi och dialys.
• EC: 3.4.21.64